Биохимические показатели при циррозе печени под влиянием фотодинамической терапии

Цирроз печени – хроническое, полиэтиологическое, диффузное, прогрессивно развивающееся заболевание печени. Ему присуще снижение числа печеночных клеток, развитие соединительной ткани, изменение ангиоархитектоники паренхимы печени с формированием регенераторных узлов. С течением времени развивается печеночная недостаточность и портальная гипертензия с асцитическим синдромом, коагулопатия, гепаторенальный синдром и другие проявления данного недуга [1–4].
Проблема коррекции регенерации печени при ее диффузных заболеваниях с целью продления резервов функционирования данного органа долгие годы является одним из краеугольных камней клинической и экспериментальной гепатологии [5–7].
Фотодинамическая терапия (ФДТ) – метод сочетанного воздействия на организм светового излучения, потенцируемый применением химических соединений, повышающих чувствительность тканей к нему, используемый в настоящее время для лечения различных состояний [8, 9]. Фотосенсибилизаторы третьего поколения отличаются от предшественников дополнительной связью с веществами, способными модифицировать исходные свойства препарата для увеличения его селективности и эффективности действия (наночастицы, липосомы, антитела, поливинилпирролидон и др.) [10]. К данной группе можно отнести лекарство отечественного производства «Фотолон» (РУП «Белмедпрепараты»), которое является соединением соли хлорина е6 с поливинилпирролидоном. Представляет интерес изучение биохимических показателей и аминокислотного спектра плазмы крови при ЦП под влиянием ФДТ и данного препарата.
Исследование производилось в соответствии с принципами Европейской конвенции по защите лабораторных животных (Страсбург, 1986). В эксперименте были использованы 44 белых самца крыс линии Вистар. Им проводилось моделирование развития ЦП подкожным введением 66%-ного раствора CCl4 в растительном масле в дозе 0,3 мл 4 раза в неделю в течение 6 месяцев. Затем воздействие CCl4 прекращалось, и крысы были разделены на 6 групп (табл. 1).
ФДТ осуществлялась следующим образом. Через день после последнего введения CCl4 крысам внутривенно (в хвостовую вену) применялся «Фотолон» в дозе 3,0 мг/кг, через 3 часа после этого проводился сеанс облучения печени в дозе 10 Дж/см2 с использованием лазерного аппарата, генерирующего излучение красного спектрального диапазона с длиной волны 670 нм, совпадающей с максимумом спектрального поглощения препарата. На данный способ коррекции регенерации печени оформлена заявка на выдачу патента на изобретение Республики Беларусь.
Для биохимического исследования забиралась плазма крови животных. В ней устанавливалось содержание альбумина, активность аланинаминотрансферазы (АлАТ), аспартатаминотрансферазы (АсАТ), щелочной фосфатазы (ЩФ), гаммаглутамилтрансферазы (ГГТП), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), рассчитывался коэффициент Де Ритиса. Определение свободных аминокислот (АК) плазмы крови проводили на аминокислотном анализаторе ААА339Т. Статистическая обработка выполнена с использованием пакета программ Statistica 7.0 и Microsoft Excel 2010. Поскольку большинство исследуемых количественных признаков не подчинялись нормальному распределению, то при сравнении показателей применялись методы непараметрической статистики, а для описания результатов вычисляли медиану (Ме) 25-й и 75-й процентили (табл. 2).
Видно, у крыс с ЦП, которые выводились из эксперимента через 7 дней после окончания затравки (группа 3), сохранялись те же изменения, как и непосредственно после ее окончания: уровень билирубина был выше в 2,59 раза, активность ЛДГ – в 1,45 раза, ЩФ – в 1,55 раза, ГГТП – в 2,1 раза, уровень альбуминов в 1,17 раза меньше, чем у интактных животных. В то же время следует отметить падение показателя АлАТ (на 54,9%) и коэффициента Де Ритиса (на 41,5%) по сравнению с группой с ЦП, что может свидетельствовать о снижении синдрома цитолиза после отмены ксенобиотика.
В группе 4 (животные с ЦП, которым применялась разработанная методика ФДТ, выведенные из эксперимента через 7 дней после окончания затравки) повышенной оставалась лишь активность ЛДГ (в 1,51 раза по сравнению с интактными крысами), также был понижен уровень альбумина (в 1,14 раза). Значения других показателей статистически значимо не отличались от интактных животных. При этом общий билирубин был ниже в 1,64 раза, активность ЩФ – в 1,46 раза, ГГТП – в 2,65 раза по сравнению с группой животных с ЦП через 7 дней после окончания затравки без применения ФДТ. Все это свидетельствует о положительном влиянии предложенной методики на функциональное состояние гепатоцитов при ЦП уже через неделю после лечения.
У крыс с ЦП через 30 дней после окончания затравки, несмотря на отсутствие токсического влияния CCl4, некоторые биохимические показатели крови свидетельствовали об ухудшении функционального состояния печени. Повышенными в сравнении с индикаторами в группе интактных животных были уровень общего билирубина – в 2,16 раза, активности АлАТ – в 2,01 раза (коэффициент Де Ритиса – в 1,74 раза), ЛДГ – в 1,38 раза, ГГТП – в 2 раза, а активность ЩФ – в 3,16 раза. Оставался пониженным в 1,2 раза уровень альбумина. Таким образом, биохимические изменения сохраняются через месяц после окончания индукции ЦП.
У животных с циррозом печени, к которым применялась разработанная методика ФДТ, выведенных из эксперимента через 30 дней после окончания затравки, отмечена нормализация показателей (исключение составляет лишь уровень альбуминов – он остался сниженным в 1,2 раза). Они были статистически значимо меньше, чем у животных с ЦП без лечения в те же сроки: общий билирубин – в 2,16 раза, АлАТ – в 2,96 раза, коэффициент Де Ритиса – в 2 раза, ЩФ – в 4,4 раза, ЛДГ – в 3,1 раза, ГГТП – в 2,86 раза.
Приведенные данные свидетельствуют об оптимизирующем воздействии разработанного метода ФДТ на биохимические показатели крови. Это указывает на улучшение функционального состояния гепатоцитов при ЦП под влиянием предложенной терапии. Положительные сдвиги отмечены уже через 7 дней, а наибольшая эффективность выявлялась через месяц после окончания воздействия.
При анализе аминокислотного спектра крови у крыс получены следующие данные. Через неделю после прекращения введения CCl4 происходили изменения аминокислотного пула плазмы крови экспериментальных животных (табл. 3).
В группе крыс с ЦП через 7 дней после окончания затравки, не получавших лечения, отмечалось некоторое улучшение показателей в сравнении с животными с циррозом печени непосредственно после окончания затравки: снижалось суммарное содержание аминокислот (на 20%), ААК (на 17%). Однако данные значения все же были выше, чем в группе интактных животных (в 1,36; 1,33 и 1,4 раза соответственно). Более высоким (в 1,14 раза) в сравнении с интактными животными было соотношение АРУЦ/ААК, свидетельствующее о нарушении функционального состояния печени.
На фоне применения ФДТ выявлялась нормализация описанных ранее изменений интегральных показателей аминокислотного пула: общее количество АК снизилось на 38%, протеиногенных – на 38%, заменимых АК – на 43%, незаменимых – на 37%, АРУЦ – на 30%, ААК – на 45% в сравнении с группой с ЦП непосредственно после окончания затравки. При этом значения ряда данных показателей были статистически значимо меньше, чем в группе с ЦП через 7 дней после окончания затравки без лечения (р<0,05). Это может указывать на активацию синтетических процессов в ткани печени и снижение катаболизма белков под воздействием проведенного сеанса ФДТ [11, 12].
Изменения отмечены и в содержании отдельных АК (табл. 4).
У крыс с циррозом печени через 7 дней после окончания затравки было выше содержание глутамина (в 1,68 раза, р<0,05), тирозина (в 1,52 раза, р<0,05), триптофана (в 1,51 раза, р<0,05), фенилаланина (в 1,49 раза, р<0,05), а также оксипролина (в 1,95 раза, р<0,05), чем у интактных животных. Это свидетельствует о сохранении метаболических нарушений через неделю после окончания индукции ЦП.
У крыс с циррозом печени через 7 дней после окончания затравки на фоне применения ФДТ происходило более значимое изменение в процессах обмена АК и их производных. Большинство указанных показателей практически не отличалось от группы интактных животных, что может свидетельствовать о положительном влиянии данной методики на течение описанных метаболических процессов, полной нормализации которых не наблюдалось в группе животных, не получавших лечения. При этом меньшими в сравнении с группой с ЦП через 7 дней после окончания затравки без лечения были значения глутамина (в 1,34 раза, р<0,05), изолейцина (в 1,38 раза, р<0,05), фенилаланина (в 1,39 раза, р<0,05).
Наиболее выраженная динамика содержания АК в плазме крови отмечена через месяц после отмены введения ксенобиотика (табл. 5–6).
Как видно из табл. 5, основные показатели, повышенные у крыс с циррозом печени, в обеих группах через 30 дней после окончания затравки падали. При этом на фоне применения ФДТ данное снижение было более выражено. В результате значения изучаемых индикаторов были статистически значимо меньше, чем в группе без применения ФДТ: суммарное содержание АК – в 1,43 раза, содержание протеиногенных АК – в 1,43 раза, заменимых – в 1,53 раза (р<0,05). Особое внимание следует обратить на отсутствие динамики в содержании ААК у животных, не получавших ФДТ, в результате чего и коэффициент АРУЦ/ААК практически не отличался от группы животных с ЦП непосредственно после окончания затравки. Это свидетельствует о сохраняющемся нарушении функционального состояния гепатоцитов, несмотря на прекращение введения CCl4. В группе животных с ЦП через 30 дней после окончания затравки на фоне применения ФДТ отмечалось уменьшение суммарного содержания ААК на 51,5% (р<0,05), увеличение индекса АРУЦ/ААК – на 26,1% (р<0,05), при этом суммарная концентрация ААК была статистически значимо ниже, чем в группе без лечения на те же сроки, а индекс АРУЦ/ААК выше (в 1,72 и 1,24 раза соответственно, р<0,05). Таким образом, применение ФДТ способствует нормализации белок-синтетической функции печени, оказывает положительное влияние на функциональное состояние ее клеток.
Несмотря на прекращение влияния токсина, через месяц сохранялись изменения в содержании отдельных АК плазмы крови экспериментальных животных (табл. 6).
Содержание ААК в группе животных с ЦП через 30 дней после окончания затравки не изменилось в сравнении с показателями в группе с ЦП непосредственно после окончания затравки. В то время как в группе крыс на фоне применения ФДТ в те же сроки концентрация тирозина снизилась на 51% (р<0,05), триптофана – на 63% (р<0,05), фенилаланина – на 51% (р<0,05) в сравнении с показателями в группе с ЦП непосредственно после окончания затравки. При этом они были ниже, чем у животных с циррозом печени с ЦП на том же сроке без лечения в 1,84, 2 и 1,69 раза соответственно (р<0,05).
Концентрации аспарагиновой, глутаминовой кислот, аспарагина, глутамина в группе крыс через 30 дней после окончания затравки на фоне применения ФДТ снизились на 53%, 29%, 28% и 52% соответственно в сравнении с показателями в группе с ЦП непосредственно после окончания затравки, а в группе животных, не получавших лечения через месяц после окончания затравки, статистически значимо упало только содержание аспарагиновой (на 38%) и глутаминовой (на 31%) кислот. Соотношение АК/ГАМК на фоне применения ФДТ в данном сроке составило 258,1 (127,8; 590), то есть снизилось на 74,8% (р<0,05) в сравнении с группой животных с ЦП непосредственно после окончания затравки (1026,2 (820,5; 1500)). В группе без лечения данное соотношение практически не изменилось (685,8 (634,2; 1049)) и было выше, чем в группе с применением ФДТ в 2,66 раза (р<0,05). Это может говорить об улучшении баланса основных нейротрансмиттеров под влиянием применяемой методики.
Через месяц после окончания введения CCl4 в обмене серосодержащих соединений в группе с ЦП без лечения наблюдалась следующая динамика. Несколько упал уровень таурина (на 30%), почти не изменилась концентрация метионина, сохранялся повышенным уровень цистатионина. При применении ФДТ концентрации серосодержащих АК изменялись более выраженно: таурин – на 41%, метионин – на 37%, цистатионин – на 86%. Они также статистически значимо были ниже, чем в группе без лечения (в 1,19; 1,43 и 5,81 раза соответственно, р<0,05), и при этом не отличались от таковых в группе интактных животных. Описанные изменения демонстрируют нормализующее влияние ФДТ на процессы метаболизма серосодержащих АК. Это может косвенно свидетельствовать о повышении антиоксидантного потенциала [13, 14].
Использование предложенного нами способа воздействия приводило к снижению на 53% содержания глицина, за счет чего оно было в 1,77 раза ниже, чем в группе без лечения (р<0,05). С одной стороны, это указывает на активацию белок-синтетических процессов в гепатоцитах, с другой – на активацию метаболизма данной АК для образования биологически важных веществ в печени.
Индикаторные для состояния соединительной ткани АК (пролин и оксипролин) при данном способе лечения уменьшились на 55% и 52% (р<0,05) по сравнению с ЦП (группа 2). Они были статистически значимо ниже, чем у крыс с ЦП через 30 дней после окончания затравки (группа 5), в 1,77 и 1,63 раза соответственно, что подтверждает стабилизирующее влияние ФДТ на течение метаболических процессов в соединительной ткани при ЦП [15, 16].
На основании изложенного можно сделать вывод о нормализующем влиянии предложенного метода лечения на биохимические показатели крови, что говорит об улучшении функционального состояния гепатоцитов при ЦП. Положительные сдвиги определяются уже через неделю после терапии и достигают максимума через месяц после окончания воздействия. Проведенное экспериментальное исследование указывает на целесообразность изучения перспектив применения данной методики в клинических условиях у пациентов с циррозом печени.