Применение дендримеров в генетической терапии

Нанотехнологии
Использование нанотехнологий в биологии и медицине ознаменовалось бурным прогрессом этих отраслей благодаря появлению новых приборов, супрамолекулярных систем, структур, комплексов и композитов [1]. Одним из ярких примеров нанотехнологических композитов являются дендримеры, исследование которых ведется согласно концепции и документам 7-й Рамочной программы Европейского Союза в разделах «Нанотехнология», «Нанобиология» и «Наномедицина». Дендримеры имеют форму шара. Их структура образована расходящимися во все стороны от центрального ядра ветвями мономерных субъединиц (рис. 1) [2]. Выбирая в процессе синтеза мономеры и функциональные группы, можно точно задавать свойства получаемых макромолекул. Необычная природа дендримера — некоторое следствие его уникальной архитектуры. Так, один из интересных топологических аспектов — лимит роста дендримеров. Если число мономеров возрастает экспоненциально, как функция поколения, а сфера способна расширяться, как куб поколения, то существует точка, при которой дендример не может расти из-за отсутствия места для его поверхностных концевых групп. Аналогично, увеличение плотности ветвей при росте поколения также влияет на структуру дендримеров. При высоких поколениях стерические ограничения ведут к формированию глобулярных конформаций. Концы ветвей могут находиться как на поверх¬ности, так и входить внутрь структуры дендримера в зависимости от природы растворителя и концевых остатков. В первом случае, как показали результаты компьютерного моделирования, дендримеры могут иметь в своей структуре полости и каналы, которые можно использовать для взаимодействий «хозяин-гость» и транспорта веществ.
Интересной особенностью дендримеров является зависимость вязкости их раствора от молекулярной массы [2]. Если для линейных полимеров их вязкость в растворе описывается степенной функцией: ?~CN, где С — концентрация полимеров, а N — степенной параметр, то вязкость растворов дендримеров описывается линейной функцией: ?=?0(1+k?), где k — постоянная, а ? — объемная доля дисперсной фазы. Таким образом, при увеличении поколения дендримеров (их молекулярного веса) при определенной точке начинается снижение их вязкости в растворе. Данный эффект — следствие глобулярных размеров высоких поколений. В настоящее время с учетом модификаций синтезировано более ста видов дендримеров. Из них можно выделить пять наиболее распространенных семейств:
• полиамидоаминные (ПАМАМ) — основаны на этилендиаминном ядре, их ветви сконструированы из метилакрилата и этилендиамина; в настоящее время имеется их большой выбор с поверхностными группами самого различного типа;
• полипропиленоиминные (ППИ) — основаны на бутилендиаминном ядре и полипропилениминовых мономерах. Кроме ППИ, используется популярная аббревиация ДАБ (диаминобутил) — по названию ядра; коммерчески доступны;
• фосфорные — в их ядре и ветвях присутствуют атомы фосфора;
• карбозилановые — имеют в основе кремниевое ядро и амониевые или аминогруппы на периферии;
• полилизиновые — основаны на аминокислоте лизине и имеют полилизиновые ветви и поверхностные группы; коммерчески доступны.

Использование дендримеров в генетической терапии
Генетическая терапия — одно из наиболее перспективных направлений для лечения многих заболеваний. Она уже вошла в практику мировой клинической медицины (аденовирусная генетическая терапия официально разрешена в Китае [3]), невзирая на ее побочные действия и потенциальные риски. Одним из основных барьеров, тормозящих дальнейшее ее развитие, является проблема доставки нуклеиновых кислот (ДНК, РНК, олигонуклеотидов) в конкретные органы и ткани. Осуществляться она может с помощью большого множества вирусных и невирусных систем доставки, называемых часто векторами, каждая их которых имеет свои преимущества и недостатки. Вирусные векторы наиболее эффективны, однако их обратная сторона — высокая иммуногенность и канцерогенность in vivo [4]. По сравнению с вирусными системами синтетические (невирусные) характеризуются меньшей результативностью, но большей гибкостью и безопасностью. Для понимания необходимости систем доставки нуклеиновых кислот кратко остановимся на описании их барьеров в организме.
Свободная плазмидная ДНК может быть доставлена в скелетные мышцы, печень или, в некоторых ограниченных случаях, напрямую в область опухоли. В большинстве же случаев при систематической циркуляции в крови происходит ее ферментная деградация, что приводит к необходимости наличия систем для упаковки и транспорта плазмидных нуклеиновых кислот. Этот процесс происходит с участием векторов (как вирусных, так и невирусных), которые упаковывают данные кислоты, защищают их от деградации (рис. 2) и помогают доставлять в нужные для их локализации регионы, а также обеспечивают эффективный внутриклеточный транспорт, как правило, к ядру. Наиболее общая стратегия, применяемая для упаковки нуклеиновых кислот, основана на электростатическом взаимодей¬ствии между ее анионными фосфатными группами и положительными зарядами синтетического вектора, которое ведет к их комплексации и конденсации в наночастицы. Суспензии таких частиц могут быть коллоидально стабильными только в том случае, когда частицы являются заряженными, поэтому катионный носитель должен присутствовать в избытке, чтобы обеспечить взаимное отталкивание частиц. Кроме того, положительный заряд наночастиц способствует их связыванию с клеточными рецепторами и входу в клетки, помогает эффективному поглощению наночастиц с помощью эндосом.Так, согласно рис. 3, сначала в условиях in vitro дендример формирует комплекс с нуклеиновой кислотой, который затем добавляется к клеткам in vitro или вводится животным в условиях in vivo или ex vivo. Доставка дендриплексов в места их локализации может осуществляться с кровотоком, после чего происходит интернализация дендриплекса клетками и формируются дендриплекссодержащие эндосомы. При изменении рН с 7,4 (внеклеточное рН) до 5,5 (внутриклеточное рН) происходит депротонирование поверхностных групп дендримера, разрушение дендриплекса и высвобождение нуклеиновой кислоты. Одновременно происходит лизис эндосомы и свободная нуклеиновая кислота выходит в цитоплазму.
Однако если такое зарядовое соотношение может быть преимуществом в упрощенных экспериментах in vitro, то в in vivo это способно привести к активному неспецифическому связыванию комплексов любыми клетками, биологическими поверхностями и компонентами крови, которое, в свою очередь, модифицирует комплексы, делает их менее стабильными и усложняет их доставку в органы и ткани-мишени. Когда комплексы достигнут клеток-мишеней, необходимо, чтобы они были правильно поглощены клеткой для обеспечения транспорта из эндосом в цитоплазму и в конце концов к ядру. Этот путь требует преодоления различных внутриклеточных компартментов, и снижение эффективности на данном этапе — одно из ключевых ограничений для синтетических невирусных векторов.
В настоящее время наиболее широко используемыми невирусными векторами являются комплексы нуклеиновых кислот с липосомами и различными катионными линейными полимерами. Эти комплексы с липосомами называются липоплексами, с линейными полимерами — полиплексами. Дендримеры с положительно заряженными группами связываются с нуклеиновыми кислотами, и по аналогии с полиплексами и липоплексами такие комплексы стали называть дендриплексами. Данный класс полимеров имеет структурные преимущества для транспорта генов. Дендримеры монодисперсны, стабильны, обладают сравнительно низкой вязкостью при высоком молекулярном весе и множеством концевых групп, которые могут быть ионизированы, то есть могут эффективно связывать большое число генетического материала.
Применение дендримеров для трансфекции генов
В 1993 г. впервые были опубликованы результаты исследований о том, что люциферазо- и ?-галактозидазосодержащие плазмидные ДНК могут быть доставлены в клетки с помощью ПАМАМ-дендримеров [5]. В 1996 г. появились данные исследований об эффективности трансфекции генетического материала при помощи дендримеров на различных клеточных линиях [6]. Было показано, что различные поколения протонированных дендримеров взаимодействуют с отрицательно заряженными плазмидными ДНК, и этот комплекс стабилен при физиологических условиях даже в присутствии додецилсульфата натрия. Результативность трансфекции зависела от типа дендримеров и наличия ДЭАЕ-декстрана. В некоторых случаях эффективность трансфекции дендримерами в 10—100 раз превышала эффективность коммерческих катионных липидов.
Дендримеры могут применяться для переноса генов с целью лечения злокачественных новообразований. При генетической терапии рост опухоли может быть заингибирован с помощью контроля ангиогенеза. В исследованиях эффективности ден¬дримеров как носителей генов при раке молочной железы ПАМАМ-дендримеры ассоциировали с 36-мерными анионными олигомерами для доставки ангиостатина и генов тканевого ингибитора металлопротеиназы (TIMP-2) [7]. Сначала способность дендриплексов обеспечивать трансфер генов в область локализации опухоли молочной железы была проверена in vitro с использованием плазмидного кодона для зеленого флуоресцентного белка. Затем была проанализирована эффективность трансфера генов ангиостатина и TIMP-2 к местам локализации опухоли in vitro и установлено значительное уменьшение пролиферации эндотелиальных клеток и блокирование восстановления эндотелиальных и раковых клеток. На конечном этапе работы трансфер генов в опухолевую область был проверен на мышах in vivo. Результаты оказались обнадеживающими: наблюдалось существенное снижение роста опухолей.
В последнее время установлено, что эффективность генетического транспорта связана не только с доставкой в клетку ДНК c целью синтеза генов, но и с доставкой одноцепочечных антисмысловых олигодеоксинуклеотидов (ОДН) — для блокировки мРНК и, тем самым, блокировки трансляции вредных, кодирующих заболевание генов. В другом случае транскрипция может быть нарушена связыванием триплексформирующего олигонуклеотида к региону промотора гена-мишени ДНК. Для транспорта ОДН необходимы эффективные системы доставки, так как сами ОДН очень плохо проходят через клеточные мембраны и быстро разрушаются клеточными нуклеазами. Для увеличения эффективности доставки олигодеоксинуклеотидов в клетки и были применены дендримеры. Показано, что ПАМАМ-дендримеры могут быть использованы как агенты для транфекции антисмысловых ОДН [8]. Они достигали ингибирования экспрессии соответствующих генов при пикомолярных концентрациях ОДН и при этом не проявили какой-либо цитотоксичности. Установлено, что полиамидоаминный дендример может формировать стабильные комплексы с участком TAR мРНК вируса ВИЧ-1 и нарушать взаимодействие Tat-пептида с этим участком [9]. Данное взаимодействие критично для продукции вирусных транскриптов и пролиферации вируса. Вещества, связывающиеся с участком TAR мРНК и препятствующие его связыванию с Таt, являются генно-инженерными средствами для ингибирования репликации ВИЧ-1. Полиамидоаминные дендримеры улучшали доставку ОДН ANTITAR для связывания с участком ТАR. Для связывания различных антисмысловых ОДН, направленных против вируса ВИЧ-1, успешно использованы карбозилановые дендримеры [10—11]. Установлено, что применение дендриплексов на основе карбозилановых дендримеров приводило к снижению уровня антигена p24 (маркера вируса ВИЧ-1) в клетках линии МТ-2, что свидетельствует об эффективности переноса антисмысловых ОДН с помощью карбозилановых дендримеров. Показано также, что формирование дендриплекса между карбозилановым дендримером и ОДН предотвращает их взаимодействие с сывороточным альбумином, которое, как известно, наряду с деградацией нуклеиновых кислот протеазами крови, является основным препятствием для доставки свободных НК в пораженные органы и ткани при генетической терапии [10—11].
Исследование механизмов регуляции активности генов в последние годы привело к обнаружению нового механизма подавления экспрессии генов — РНК-интерференции, заключающейся в способности двуцепочечной РНК (дцРНК) вызывать специфическую деградацию мРНК-мишени, последовательность которой комплементарна одной из цепей дцРНК. Длинные дцРНК, попадая в клетку, подвергаются эндонуклеазному расщеплению на короткие, длиной 19—21 bp, двуцепочечные фрагменты с двумя выступающими нуклеотидами на 3’ концах цепей. Эти короткие дуплексы, получившие название siRNA (short interfering RNAs, малые интерферирующие РНК — миРНК), в составе комплекса с белками образуют каталитические структуры, вызывающие направленную деградацию комплементарной им мРНК-мишени. В настоящее время РНК-интерференция активно используется для регуляции экспрессии генов и как метод изучения функ¬циональной геномики эукариот. Так же как и для остальных нуклеиновых кислот, одним из главных ограничений применимости интерференции РНК для генетической терапии является доставка миРНК в клетку. Нами совместно с польскими и испанскими коллегами для доставки миРНК в мононуклеарные клетки периферической крови и клетки лимфоцитарной линии SupT1, пораженные вирусом ВИЧ-1, были применены карбозилановые дендримеры первого и второго поколений [10]. Дендриплексы показали свою низкую токсичность и высокую эффективность доставки миРНК в клетки, в результате чего значительно снижалась репликация вируса ВИЧ-1. Была проверена возможность использования и ПАМАМ-дендримеров для трансфера миРНК in vitro [12]. Установлено, что ПАМАМ-дендримеры 7-го поколения эффективно переносили миРНК для блокировки транскрипции гена GL3Luc.
Таким образом, прогресс в области молекулярной генетики и генетической инженерии дает специалистам новые возможности диагностики и лечения различных заболеваний.