Высшие грибы в комплексной терапии злокачественных новообразований

Развитие биотехнологии и микологии привело к появлению новой отрасли этих наук — фармацевтической микологии, основной целью которой стало создание лекарственных препаратов нового поколения. Особый интерес вызывают базидиальные грибы как источник новых эффективных и безопасных противоопухолевых природных веществ [1]. Исследованием их лечебных свойств и практическим применением в медицине активно занимаются ученые многих стран, прежде всего Китая, Японии, Кореи, США.
Следует отметить, что до настоящего времени большинство препаратов из грибов не выпускаются и не имеют разрешения на медицинское применение как в России, так и в Беларуси вследствие недостаточно высокого уровня биотехнологических производств. Поэтому, прежде чем решать эти проблемы, необходимо развивать само грибоводство, учитывая тот факт, что грибы — это натуральные продукты, содержащие широкий ряд биологически активных веществ, необходимых для сохранения здоровья населения. Так, в базидиомах высших грибов в пуле липидов содержится до 90% линолевой кислоты, которая входит в состав таких известных лечебных препаратов, как «Эссенциале», «Липостабил», получаемых из растительного и животного сырья. В базидиальных грибах есть все необходимые микроэлементы и витамины, а также антиоксиданты и ценные протекторные соединения (трегалоза и маннит), предохраняющие мембраны при стрессорных воздействиях.
Экспериментальные исследования по поиску грибов-базидиомицетов, обладающих противоопухолевой активностью, и оценке эффективности их употребления на различных моделях патологических состояний должны явиться основой для разработки препаратов из природного сырья, которые могут быть использованы в онкологической практике.
Цель работы — изучить радиозащитные свойства водных экстрактов грибов, их влияние на рост и развитие опухолевого процесса в легких у мышей линии Af, а также возможности повышения эффективности цитостатической терапии аденокарциномы Эрлиха.
В работе исследовалась функциональная активность грибов — опенка зимнего (Flammulina velutipes) и аурикулярии уховидной (Auricularia auricularia-judae), выращенных в лаборатории пищевых и лекарственных ресурсов леса Института леса НАН Беларуси, а также веселки обыкновенной (Phallus impudicus), произрастающей в лесах Гомельской области.
Противоопухолевую активность водных экстрактов грибов исследовали в тесте с определением выхода спонтанных и индуцированных химическим мутагеном — уретаном аденом в легких у мышей линии Af. Эти группы характеризуются наследственной предрасположенностью к опухолеобразованию в легких и высокой чувствительностью легочной ткани к бластомогенному действию уретана. В процессе развития у интактных мышей возникают спонтанные опухоли легких, число которых увеличивается под действием мутагенных и канцерогенных факторов. Экспериментальные животные обоего пола были разделены на 6 групп.
1-й группе интактных мышей вводили однократно внутрибрюшинно (в/б) физиологический раствор (10 мл/кг); 2-й — уретан (1 мг/г). Мыши 3-й группы 14 дней принимали водный экстракт аурикулярии уховидной (4 г/л); животным 4-й группы после приема в течение 14 дней водного экстракта аурикулярии однократно в/б вводили уретан (1 мг/г). По аналогичной схеме мыши 5-й группы принимали на протяжении 14 дней с питьем водный экстракт опенка зимнего (4 г/л), а 6-й — после 14-дневного приема экстракта гриба однократно в/б вводили уретан (1 мг/г).
Через 20 недель после введения уретана мышей выводили из эксперимента методом цервикальной дислокации шейных позвонков с соблюдением правил проведения работ с использованием экспериментальных животных. Выделенные легкие фиксировались в 10%-ном растворе формалина. После подсчета аденом определялись количество аденом/мышь и частота опухолеобразования (% мышей с аденомами).
Радиозащитные свойства опенка зимнего оценивались частотой индуцированных аденом в легких у мышей после употребления с питьем водного экстракта этого гриба (12 г/л) и внешнего облучения животных в суммарной дозе 7 Гр (137Cs) дважды (по 3,5 Гр) с интервалом в месяц: водный экстракт гриба употреблялся в течение 1 месяца до первого облучения и впоследствии до вывода животных из эксперимента.
Радиозащитные и противоопухолевые свойства при приеме мышами водного экстракта веселки обыкновенной исследовались в следующих тестах.
Первый. Мыши линии Af контрольной и опытных групп подвергались общему однократному действию ?-излучения в дозе 7 Гр (Сs137), после чего находились на стандартном рационе вивария. Мыши опытных групп получали вместо воды без ограничения водный экстракт гриба веселки обыкновенной (4 г/л): 1-я — в течение 7 суток до облучения; 2-я — в течение 7 суток после облучения. Изучалась выраженность клинической картины острой лучевой болезни по параметрам выживаемости облученных мышей и динамике изменения массы тела (взвешивание производилось каждые трое суток, первое взвешивание — через 3 суток после облучения).
Второй. Исследования по изучению влияния водного экстракта веселки обыкновенной на рост опухолей и эффективность цитостатической терапии циклофосфаном (ЦФ) проводились на мышах-самках линии Af весом 19—22 г, которым перевивались под кожу клетки асцитной аденокарциномы Эрлиха (АКЭ) в дозе по 6 млн клеток на мышь. Половине всех животных после перевивки опухолевых клеток ежедневно давали с питьем водный экстракт веселки обыкновенной, остальные получали водопроводную воду. Через 2 недели после перевивки опухолевых клеток половине животных, употреблявших экстракт веселки, и половине животных, получавших водопроводную воду, однократно в/б вводился цитостатический препарат ЦФ в дозе 100 мг/кг, остальные мыши получали эквиобъемные количества физиологического раствора. О скорости роста опухоли судили по изменению ее объема, определяемого по формуле: V = (a*b*c*?)/6, где a, b, c — три взаимно перпендикулярных диаметра опухоли, 1/6 ? = 0,52 — постоянная величина, V — объем опухоли (в см3). Торможение роста опухоли (ТРО, %) при раздельном и комбинированном режиме лечения ЦФ и экстрактом веселки вычисляли по формуле ТРО = (Vк ? Vоп) / Vк х 100%, где Vк — средний объем опухоли в контроле, Vоп — средний объем опухоли в опытной группе. Определяли процент животных, у которых опухоли подвергались практически полной регрессии (были менее 0,07 см3 или не прощупывались при пальпировании).
При исследовании влияния водных экстрактов грибов на уровень спонтанного и индуцированного введением уретана процесса опухолеобразования в легких у мышей линии Af было установлено, что у животных, употреблявших в течение 14 дней водный экстракт аурикулярии уховидной, через 20 недель количество спонтанных аденом в легких соответствовало уровню интактного контроля (табл. 1).
Данные в таблицах представлены как среднее арифметическое ± стандартное отклонение (М ± m).
Введение интактным животным уретана привело к значительному росту числа аденом. Так, количество аденом на мышь в этой группе составило 17,0 ± 2,73, а опухоли регистрировались у всех особей.
Профилактический прием экстракта аурикулярии уховидной перед уретановой интоксикацией более чем в 3 раза снизил количество образующихся у одного животного аденом по сравнению с группой «уретан» (p < 0,05). Однако, как и после уретановой интоксикации, аденомы регистрировались у 100% животных.
У мышей, употреблявших в течение 14 дней водный экстракт опенка зимнего, через 20 недель количество аденом в легких было статистически достоверно снижено по сравнению с уровнем контроля (p < 0,05) (табл. 1). Частота опухолеобразования (процент мышей, у которых были зафиксированы аденомы) также была снижена по сравнению с контролем.
У животных, принимавших в течение 14 дней водный экстракт опенка зимнего, после введения онкогенного промотора уретана среднее количество аденом на одну особь существенно возросло по сравнению с уровнем интактного контроля, однако было ниже, чем у животных, которым уретан вводили на фоне приема питьевой воды (табл. 1). Следует отметить, что после профилактического приема водного экстракта этого гриба частота случаев с новообразованиями снижалась на 10%. Таким образом, водные экстракты изученных грибов оказывают ингибирующее действие на спонтанный (только в опытах с опенком) и индуцированный онкогенез в легких.
Исследованием воздействия ?-излучения на уровень опухолеобразования в легких у мышей линии Af было установлено, что облучение индуцировало повышение количества аденом/мышь, а также процент животных, у которых определялись аденомы, по сравнению с уровнем интактного контроля (табл. 2).
У облученных мышей, получавших с питьем экстракт исследуемого гриба, начиная за месяц до первого облучения и в дальнейшем до вывода животных из эксперимента, практически вдвое было снижено количество аденом/мышь и частота аденом в легких по отношению к аналогичным значениям у облученных мышей, которые не принимали грибные экстракты (табл. 2).
Известно, что клиническая картина острой лучевой болезни характеризуется наличием диспептического, костно-мозгового и других синдромов. Диспептический синдром после однократного облучения мышей в дозе 7 Гр проявлялся выраженным снижением массы экспериментальных животных на протяжении 14—18 суток после воздействия. Результаты исследования показали, что этот синдром у мышей, которые с питьем принимали экстракт веселки обыкновенной, как до, так и после облучения был выражен слабее, что отразилось не только в меньшем снижении массы тела, но и более раннем ее восстановлении до уровня нормы (табл. 3).
Кроме того, употребление водного экстракта веселки повысило количество выживших животных. Так, в группе мышей, которые в течение недели после облучения принимали водный экстракт гриба, количество выживших особей было в 2,7 раза выше, чем в группе облученных мышей, пивших воду (табл. 3). Наибольший терапевтический эффект от употребления экстракта веселки на состояние животных, подвергнутых облучению, отмечался при профилактическом приеме — выживаемость при этом увеличивалась в 3,95 раза по сравнению с облученными мышами, которые пили воду. Таким образом, введение животным водного раствора плодовых тел веселки обыкновенной ослабляло выраженность клинической картины развития лучевой болезни, вызванной общим однократным воздействием ?-излучения. Это проявлялось в увеличении выживаемости мышей и нормализации массы тела.
В эксперименте с перевиваемой АКЭ показано, что при приеме экстракта веселки наблюдается тенденция к снижению объема опухоли: через 21 день после трансплантации АКЭ ТРО составило 34,8%; различий по выживаемости не выявлено (табл. 4).
Введение мышам ЦФ через две недели после перевивки АКЭ привело к снижению объема опухоли на 57,9% через 21 день после ее прививки (табл. 4). Добавление в схему лечения экстракта веселки вызывало более значительное торможение роста опухоли — на 64,5% по сравнению с носителями АКЭ, не получившими лечения, и на 15,6% по сравнению с животными, обработанными ЦФ. У мышей, проживших 31 сутки и более после прививки опухоли, сохранялась та же тенденция: средние значения объема опухоли в группе, получавшей комбинированную терапию, на протяжении всего эксперимента были ниже, чем в группе цитостатического лечения в аналогичный срок (на 63,7; 72,6 и 73,3% через 31, 36 и 42 суток после инокуляции животным опухоли соответственно). Использование для лечения мышей-опухоленосителей ЦФ в комбинации с приемом водного экстракта веселки обыкновенной увеличило процент вылеченных животных, у которых опухоль подверглась практически полной регрессии, с 17 до 25%.
По механизму действия активные вещества грибов, обладающие противораковой активностью, делят на две основные группы: оказывающие непосредственное воздействие на клетки опухоли и опосредованное, за счет стимуляции иммунитета. Основная часть последних представлена полисахаридами [2], имеющими 1-3-бета-гликановые группы в главной цепи и дополнительные 1-6-бета-гликановые группы в боковых цепях, необходимые для проявления противоопухолевой активности. Результаты исследований, в которых определялась противоопухолевая активность веществ и препаратов из грибов, показали, что они способны подавлять ангиогенез [3], индуцировать апоптоз в культуре клеток рака [4], снижать активность В-клеток и потенцировать активацию Т-хелперов [5], увеличивать число моноцитов и гранулоцитов при лейкопении, вызванной введением ЦФ [6].
В противоопухолевом эффекте грибных препаратов значительная роль отводится флавоноидам. Механизм действия последних связывают с их способностью понижать активность цитоплазматической и митохондриальной АТФ-аз, что вызывает дефицит АДФ и неорганического фосфата, вследствие чего ингибируется гликолиз и подавляется развитие опухолевых клеток. Биофлавоноиды также повышают активность естественных киллерных клеток у мышей и генов-супрессоров, которые вызывают супрессию онкогенов [7]. В настоящее время флавоноиды рассматриваются как один из наиболее перспективных источников получения препаратов, способных не только проявлять прямое цитостатическое воздействие на опухоль, но и стимулировать иммунологические реакции организма [8].
Таким образом, в ходе проведенных исследований выявлено, что профилактический прием водных экстрактов опенка зимнего и аурикулярии уховидной снижает выход спонтанных и индуцированных онкогенным промотором уретаном аденом в легких у мышей линии Af. Употребление водного экстракта веселки обыкновенной в профилактическом и лечебном режиме значительно увеличивает выживаемость и улучшает общее состояние мышей, подвергнутых общему однократному облучению в дозе 7 Гр. При приеме экстракта веселки мышами — носителями АКЭ выявлена тенденция к торможению скорости опухолевого роста и снижению объемов опухоли, а также к усилению эффекта противоопухолевого алкилирующего препарата ЦФ.
Исследуемые виды грибов обладают противоопухолевыми и противолучевыми свойствами и могут служить источником для создания лечебно-профилактических препаратов, применяемых как для стабилизации состояния онкологических больных при лучевой терапии, так и для профилактики опухолеобразования при приеме лекарств, обладающих мутагенным действием. Представляются перспективными дальнейшие исследования по использованию экстрактов изученных грибов в качестве дополнительного компонента в комплексном лечении злокачественных новообразований.